基因剪刀治疗白血病的创新

英国伦敦大奥德蒙街医院和伦敦大学学院儿童健康研究所的研究人员最近采用一种新的基因疗法——分子剪刀（基因剪刀）来编辑基因，产生设计的免疫细胞，用来治疗耐药性的白血病（血癌），成功治愈了一名一岁大的白血病患儿。利用基因剪刀来治疗罕见病、难治病，尤其是遗传性疾病，是当代医学发展的一个方向。不过，基因疗法有多种，仅仅是利用基因剪刀的方式就有多种。
　　基因剪刀修饰细胞
　　
　　一岁的蕾拉·理查兹患有复发性急性淋巴细胞白血病，是一种难以治愈的白血病。尽管药物化疗能治愈一些白血病，但化疗对于复发性急性淋巴细胞白血病还是束手无策。此前，蕾拉已经接受过化疗，但效果不佳，只能用姑息疗法维持生命。在走投无路之时，大奥德蒙街医院向蕾拉的父母提议可以试用新的基因疗法，而且，这种疗法已经在小鼠身上进行过试验，效果较好。
　　为了挽救女儿的生命，蕾拉的父母同意了。蕾拉的父母热衷于尝试新疗法，蕾拉的妈妈莉莎说：“我们不想接受姑息治疗，所以我们要求医生为我们的女儿尝试任何治疗，哪怕是以前没有尝试过的。”而且，治疗方案也经过了医学伦理委员会批准，并且由掌握这一特定基因修饰方式的法国Cellectis生物科技公司提供经过基因修饰的T细胞。
　　由于蕾拉患复发性急性淋巴细胞白血病，体内正常的免疫T细胞已经很少，因此需要利用他人（供体）捐赠的健康T细胞。在利用之前，要对供体T细胞进行基因修饰，即用一种基因剪刀——转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）向健康的供体T细胞添加新的基因，将它们武装起来对抗白血病。
　　TALEN是一种可靶向修饰特异基因序列的酶，它借助于TAL效应子（一种由植物细菌分泌的天然蛋白）来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计来识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALEN。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质（基因）。此前，TALEN的特异性切割活性在酵母、拟南芥、水稻、果蝇及斑马鱼等多个动植物体系和体外培养细胞中得到验证。
　　利用TALEN对供体T细胞中的特定基因进行切割后会呈现两种效应。一是治疗白血病的药物不能损伤和杀灭基因修饰的T细胞，二是这种被修饰的T细胞被重新编程，因此，输入蕾拉的体内只是去杀灭其体内病变的白细胞。这种被修饰的T细胞称为UCART19细胞。
　　UCART19细胞由Cellectis公司研发，大奥德蒙街医院的研究人员通过静脉注射，用10分钟的时间把1毫升的UCART19细胞注入了蕾拉的血流中。然后对蕾拉进行隔离，让她不受感染，因为蕾拉的免疫系统非常虚弱。几周后，蕾拉体内的白血病细胞就明显消失。
　　然而，这并非是治疗的结束。输入的UCART19细胞只是杀灭了蕾拉体内的白血病细胞，下一步还需要接受骨髓移植来重建蕾拉被治疗摧毁的整个造血和免疫系统。不过，经检查，蕾拉的骨髓细胞是健康的，血细胞计数也在恢复正常。未来就是要找到一位配型相同的供者，由其提供健康的骨髓，移植到蕾拉体内以重建蕾拉的造血系统和免疫系统。所以，仅从蕾拉是白血病基因疗法世界第一例看，也不过是基因剪刀治疗白血病的第一步成功，或成功了一半，即把患者体内的白血病细胞清除掉。
　　多种基因剪刀治疗多种疾病
　　在利用UCART19细胞治疗白血病之前，采用另一种基因剪刀——锌指核酸酶（ZFN）治疗艾滋病也获得了初步成功。
　　ZFN又名锌指蛋白核酸酶，并非自然存在，而是一种人工改造的核酸内切酶，由一个DNA识别区域和一个非特异性核酸内切酶构成，其中DNA识别区域有特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶有剪切功能，两者结合可在DNA特定位点进行定点切割。
　　美国加利福尼亚州Sangamo生物科学公司用ZFN对供体T细胞进行基因修饰，对T细胞上一个基因删除和灭活，这个基因编码的蛋白就是艾滋病病毒（HIV）进入T细胞的结合靶分子，即T细胞受体CCR5δ32。ZFN修饰CCR5δ32基因可使其缩短，并导致其有名无实，HIV就难以识别这个T细胞的蛋白分子（大门），从而无法入侵T细胞，由此可以治疗艾滋病。
　　2014年，Sangamo公司的费奥多·乌尔诺夫研究小组对12名艾滋病患者试验，输入经过基因编辑的健康供者的T细胞，有效地抑制了HIV入侵T细胞，有6名患者停止服用抗HIV的药物，说明这种基因编辑疗法初步体现了效果。由于有了初步结果，现在Sangamo公司正在扩大试验，对70多名艾滋病患者试验这种基因编辑疗法。
　　受到这种基因编辑疗法治疗结果的鼓舞，Sangamo公司还在扩大基因疗法的战场。2015年10月，乌尔诺夫研究小组报告了他们用ZFN对猴子试验治疗血友病的结果。研究人员对15只猴子注射携带编码ZFN基因和凝血IX因子基因的病毒，以治疗血友病。白蛋白是肝脏大量合成的血液蛋白，ZFN能切割基因组中编码白蛋白的基因，并将一个健康的凝血IX因子基因导入基因组中。结果发现，猴子肝脏开始制造更多凝血IX因子，血液中凝血IX因子增加10%。
　　乌尔诺夫认为，利用ZFN和TALEN基因剪刀可以治疗多种疾病。例如，白蛋白基因类似人类基因组的一个USB接口，在这个位置也可利用ZFN或TALEN基因剪刀插入其他基因以治疗疾病。
　　不过，Sangamo公司利用基因剪刀治疗血友病还未取得美国食品与药物管理局（FDA）的许可证。2015年9月美国国立卫生研究院（NIH）一个委员会同意开展基因编辑治疗的临床研究，并可能对凝血IX因子基因治疗开绿灯。现在Sangamo公司已经向FDA提出申请，如果获得FDA批准，临床试验可望在2016年展开。更直接的基因编辑治疗疾病
　　无论是利用ZFN，还是TALEN基因剪刀治疗疾病，目前还只是在对T细胞的某种基因进行编辑、删除以治疗疾病，是一种间接的基因疗法。更为直接的用基因剪刀切除致病基因的疗法也在试验之中，这就是名为CRISPRCas的基因剪刀。
　　CRISPR的全称是，成簇的规律性间隔短回文重复序列，Cas则是指与CRISPR相关的基因。CRISPRCas技术是继ZFN、胚胎干细胞（ES）打靶和TALEN等基因编辑技术后用于定点剪切、敲除特定基因的第四种方法，不仅可以用于治疗疾病，还可能修改胚胎，创造新的物种，甚至创造“超人”。
　　现在，CRISPRCas治疗疾病的一个试验是治疗β地中海贫血。美国加州大学旧金山分校的简悦威教授及其同事在2014年8月5日的《基因组研究》发表文章称，他们尝试用CRISPRCas治疗β地中海贫血获得初步成功。β地中海贫血是由HBB基因突变引起的，会造成严重的血红蛋白缺乏。全球每10万人中有1人受到这种疾病的影响，目前还没有能够治愈β地中海贫血的办法。
　　研究人员先将β地中海贫血患者的皮肤细胞（成纤维细胞）转变为诱导的多能干细胞（iPSC），然后利用CRISPRCas编辑技术来纠正HBB特殊位点的DNA序列，即切割双链DNA中HBB突变位点。然后，细胞自身会通过同源重组用正确的核苷酸序列修复DNA。经过基因校正HBB突变之后的诱导的多能干细胞没有检测到脱靶效应，细胞保持着完全的多能性，核型也很正常。
　　之后，研究人员把这些诱导的多能干细胞分化为红细胞，结果红细胞的HBB表达恢复正常。不过，要将CRISPRCas编辑技术真正用于临床治疗β地中海贫血，还有较长的路要走。
　　采用CRISPRCas编辑技术治疗β地中海贫血的另一个思路和做法来自中国研究人员。中山大学的黄军就等人，试图用CRISPRCas9基因编辑技术对“不能存活”的胚胎（从当地生殖诊所获得，无法生成活胎的胚胎）来改造β地中海贫血的基因HBB。研究小组将CRISPRCas9注入到86个胚胎中，结果显示，有28个胚胎获得了成功的拼接，替换了突变的HBB基因。
　　然而，这一研究引发了争论。因为CRISPRCas尚不能完全准确剪切基因，所以有可能对胚胎造成伤害。因此，目前无论是利用CRISPRCas技术，还是ZFN、胚胎干细胞（ES）打靶，或是TALEN基因编辑技术，都局限在对细胞的基因编辑和敲除上，对于胚胎的基因敲除和剪切，风险很大。而且，这也涉及定制人和重造物种，伦理争论很大，法律管理也远远滞后。
　　【责任编辑】张田勘