基因疗法:从第一代走向第二代

基因疗法是通过对病人异常的致病基因进行剪接，然后用正常的基因修补致病基因，达到治愈疾病的目的。如果仅从基因疗法的方法上来区分，可以把今天的试验性基因疗法分为第一代和第二代。第一代基因疗法是利用无害的病毒（一般是腺相关病毒）作为载体，把正常基因运载到异常基因部位，以取代或纠正异常基因。第二代基因疗法则是以特定的酶作为基因剪刀来剪掉异常基因，代之以正常的基因。

　　

　　第一代基因疗法：安全是软肋

　　

　　第一代基因疗法也可称为传统基因疗法。传统的基因疗法是利用对人体无毒无害的病毒作为载体，携带基因到基因缺失或基因异常部位，以修复基因。但是，这种携带基因进行治疗的方法是随机的，不像基因剪刀一样特异性强，定向比较明确。因此传统基因疗法具有不可预测性，很可能导致一些意想不到的副作用。病人在治疗疾病的同时，由于基因导入的位置不正确，会患上另一种疾病。

　　最早的基因疗法是美国医生采用的。1990年9月，美国的弗伦奇•安德森医疗小组对一名患重症联合免疫缺陷综合征的4岁女孩进行基因注射疗法，取得成功，因而安德森被誉为“基因疗法之父”。安德森所使用的方法就是用腺相关病毒（AAV）来运载正常基因，以替换小女孩的异常基因。但是这种传统的基因疗法存在严重缺点，被病毒携带的治病基因有时不能到达病人体内的目标基因之处，而是跑到其他正常基因的部位，并产生基因调控或复制作用，导致新的疾病。

　　2002年8月，法国一个医疗小组对一名男孩进行试验性基因疗法，以治疗男孩的重症联合免疫缺陷综合征。从出生起这名男孩体内就缺乏抗感染所必需的白细胞，患儿2个月时，法国医生对他进行基因疗法。研究人员使用经过基因修饰的病毒，将患儿所缺乏的产生白细胞的基因导入其体内，但后来患儿却患了白血病。

　　对这个医疗事故进行调查后发现，男孩患白血病的原因是基因导入错误。携带治疗性基因的病毒在病人细胞的至少一个不适当位点导入了治疗性基因，新导入的基因破坏了细胞内原有的调控基因，使细胞开始不受控制地分裂，从而使患儿罹患白血病。

　　由于传统基因疗法的安全性得不到保证，尽管这类基因疗法可以治疗多种疾病，但迄今也只是一种试验性疗法，还不能进入临床作为常规疗法使用。

　　

　　第二种基因疗法：试治艾滋病

　　

　　既然用病毒携带基因不保险，为何不采用更为直接的基因疗法呢？这就是用基因剪刀把异常基因剪除，代之以正常基因。

　　剪接基因需要剪刀，这种剪刀并非人们在生活中使用的剪刀，而是一种酶分子，其名称叫作重组锌指蛋白核酸酶(ZFN)。基因剪刀由锌指蛋白与一种称为FokI的限制性内切酶组成。它可识别特定的基因位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6～8个碱基对），两个单体基因剪刀（ZFN）相互作用产生酶切功能，也就能定点剪切DNA特定片段，例如剪除异常的基因片段，并用正常基因替换异常基因，这就是第二代基因疗法的理论基础。

　　第二代基因疗法不仅可以治疗罕见的遗传病，而且可以治疗严重危害人们的疾病，如癌症和艾滋病。研究人员早就发现，艾滋病病毒（HIV）入侵人体的免疫T细胞首先是通过识别T细胞上的一些受体分子，通常有两类，一是CCR5，另一是CXCR4。迄今研究人员已鉴定出28种趋化因子受体，其中的趋化因子受体CCR5和CXCR4都与HIV-1的入侵有关，因为几乎所有的HIV-1病毒株都是利用自身的gp120蛋白与CCR5或CXCR4受体结合，或同时与这两种受体结合侵入T细胞。

　　能利用趋化因子受体CCR5侵入T细胞的HIV或其他病毒称为R5嗜性，能利用趋化因子受体CXCR4侵入T细胞的HIV或其他病毒称为X4嗜性，既能利用CCR5，又能利用CXCR4侵入细胞的病毒株则称为R5/X4嗜性。

　　由此，也为研究人员提供了一个思路，如果采用基因修剪和删除的方式，改变CCR5或CXCR4受体分子，就有可能让HIV难以识别T细胞，从而阻止HIV入侵T细胞。这一启发首先来自德国一个骨髓移植案例。德国一个医疗小组挑选了一位CCR5发生变异的骨髓捐献者，用他的骨髓治疗好了一名白血病兼HIV感染者。在治疗好了这名白血病患者两年后，病人多次检测也没有查出体内有HIV。这说明CCR5的变异让HIV难以感染新的T细胞。

　　于是，位于美国加利福尼亚州里奇蒙的一家生物科学公司——桑加莫（Sangamo）研发了一种基因剪刀，称为SB-728-902，也就是一种特殊的重组锌指蛋白核酸酶，其作用在于，这种基因剪刀可以特异性地和永久地改变T细胞DNA中为其自身细胞膜上的CCR5受体分子编码的基因。而在过去的研究中，研究人员发现，人的自然变异的CCR5分子——CCR5Δ32分子能抵御HIV的入侵，原因也在于由于基因突变导致了CCR5分子结构改变。通过锌指核酸酶（ZFN）基因剪刀对编码CCR5分子的基因进行剪切修饰，就可以人为改变CCR5分子结构，如此，HIV就找不到进攻T细胞的入口，也就能把HIV拒之门外。

　　桑加莫公司已经采用SB-728-902对6名感染了艾滋病病毒的患者进行临床一期试验，方法是，把患者的T细胞抽取出来，用SB-728-902基因剪刀加以修饰，因此，这些细胞变成了经过改造的T细胞（SB-728-T，或称ZFN-CCR5修饰细胞），再把这些经过基因改造的T细胞输回病人体内。与此同时也对这些患者采用治疗艾滋病的高效抗逆转录病毒药物治疗。

　　结果显示，这种基因疗法对患者是安全的。在6名患者中，有5名的总CD4 +T细胞（即HIV所攻击的T细胞）计数持续改善。此外，6名患者中，有5名还显示其CD4:CD8 T细胞比例（一种免疫健康指标）持续改善。他们的ZFN-CCR5修饰细胞也表现出正常T细胞的生长动力学和转运功能，这些细胞在肠道黏膜（病毒在体内主要的贮存处）进行选择性扩增，提示这些细胞可抗击HIV感染。

　　当然，对艾滋病病人进行这种基因疗法的原理还在于，这种基因疗法可以避免HIV进一步感染体内新的T细胞，而T细胞的存活期比HIV更长，HIV由于找不到新的T细胞入侵就会慢慢死亡。最终大量生长的新T细胞会在体内重建免疫功能，因此，不必服用抗HIV的药物也能让病人获得新生。

　　

　　安全同样令人担心

　　

　　从表面上看，采用基因剪刀进行基因疗法的做法比传统的基因疗法更好，因为重组锌指蛋白核酸酶（基因剪刀）比起传统的基因疗法来有更大的特异性，即直接对准目标（靶）基因。但是，利用基因剪刀进行基因疗法的安全性同样令人担心，因为基因剪刀也有不确定性。

　　美国加利福尼亚大学的分子生物学家戴维斯•西格尔认为，目前需要确定的是，基因剪刀是否准确地到达了人们所希望到达的治疗部位。基因剪刀既然有剪接和替换功能，因此没有人希望基因剪刀在人体的细胞中胡乱地剪接，从而导致其他病变，例如癌症和基因突变。

　　为了验证基因剪刀的准确性，位于海德伯格的德国癌症研究中心的肿瘤医生克里斯托夫•卡勒对重组锌指蛋白核酸酶的治疗效果进行了检验。他认为，这种基因剪刀的错误是很难发现的，因为，在治疗中这种基因剪刀潜伏在与疾病密切相关的成千上万个细胞中的任何细胞中，所以这种基因剪刀也可能对很多正常细胞进行了基因剪接，这就可能造成隐患。

　　然而，用拖网式的方法查找所有细胞是否受到基因剪刀的剪切是不太可能的。过去，研究人员检查基因剪刀是否有错误是分析基因组中何处出现酶的粘贴（在粘贴处就有可能是基因剪刀在起作用）。

卡勒和其同事采取了不同的方法，把接受治疗的细胞暴露于一种病毒，后者能把它自己嵌合到宿主基因组的断裂处。然后，他们查找细胞中的病毒基因以发现基因剪刀在何处产生剪切作用。在被检测的基因剪刀中，他们发现了基因剪接有两种脱靶效应，也就是没有对异常的疾病基因进行剪切，反而剪切了正常基因。

　　美国盐湖城犹他大学的生物化学家多娜•卡洛尔认为，这一发现具有重要意义。因为，这表明，细胞中DNA实际被剪接的位点出现了并非人们想要的结果。

　　美国哈佛大学的生物化学家大卫•刘采用了另一种方法来检查基因疗法中非目标DNA是否被剪切。他的研究团队首先筛查病毒DNA库，以寻找那些可以被基因剪刀剪切的DNA片段。然后，他们在人类基因组中查找与病毒相似的DNA片段，再把人的细胞放到培养基中培养以检测人的细胞中的这些DNA序列是否可以被基因剪刀剪切。

　　结果，研究人员发现，这种酶基因剪刀的剪接效果比预期的更广泛。而且，研究人员测试的一种酶基因剪刀与艾滋病临床试验治疗中所使用的酶基因剪刀相似。在很偶然的情况下研究人员发现，酶基因剪刀剪开了与癌症相联系的一种基因旁边的DNA。这意味着，基因剪刀可能诱发病人患癌。

　　但是，大卫•刘等人是用白血病细胞进行的酶基因剪刀的测试，而艾滋病研究的靶细胞是一种典型的免疫细胞——T细胞，所以不能简单地将两者混淆起来，而是需要进一步的研究来确认基因剪刀是否会致癌。

　　不过，桑加莫公司却认为他们的基因剪刀是有安全保障的。桑加莫公司的首席科学官员菲利普•格雷戈里指出，在大卫•刘和克里斯托夫•卡勒使用基因剪刀并验证它们的效果以来，该公司已经进一步改进了他们的基因剪刀。在用于临床试验之前，桑加莫公司对这种基因剪刀进行了无数次的安全检测，包括把基因剪刀移植进150多种动物的10亿多个遗传改造的细胞中以观察其是否有害或是否有副作用，结果并没有发现基因剪刀在滥杀无辜。所以，基因剪刀的安全性是有保障的。

　　但是，格雷戈里也认为，目前，他们的基因剪刀还需要进行活体试验，因为美国食品和药物管理局的管理者不可能放弃这种基因剪刀对于活体动物安全性试验的要求，所以能否广泛使用这种基因剪刀有待更多的研究结果才能确认。

　　现在，由于新的研究提出了重组锌指蛋白核酸酶（基因剪刀）可能也会对正常细胞的基因进行剪接，因而对这种新的基因疗法的安全性提出了挑战。当然，如果进一步的研究能够解决安全性问题，让第二代基因疗法只针对特定的靶细胞和靶基因，而不破坏正常细胞的基因，这种疗法将会成为未来理想的基因疗法。

　　【责任编辑】张田勘